Microscopio electrónico de transmisión
La microscopía electrónica de transmisión (MET) ha sido una tecnología importante en biología celular desde que se utilizó por primera vez a principios de la década de 1940.
Es utilizada con mayor frecuencia en biología celular implica obtener imágenes de secciones delgadas teñidas de células incrustadas en plástico mediante el paso de un haz de electrones a través de la muestra, de modo que el haz sea absorbido y dispersado, produciendo contraste y una imagen.
Debido a la longitud de onda corta del haz de electrones (100,000 veces más corto que los fotones en la luz visible), el MET puede lograr una resolución subnanométrica, muy por debajo de la de los microscopios ópticos de resolución más alta.
El MET ha demostrado ser valioso en el análisis de casi todos los componentes celulares, incluido el citoesqueleto, los sistemas de membranas, los orgánulos y los cilios, así como estructuras especializadas en células diferenciadas, como las microvellosidades y el complejo sinaptonémico.
Preparación de las muestras
Las células se fijan químicamente a temperatura ambiente utilizando glutaraldehído, seguido de tetróxido de osmio. El glutaraldehído principalmente entrecruza proteínas. El tetróxido de osmio reacciona fuertemente con los lípidos de la membrana y también con las proteínas. El osmio es un metal lo suficientemente pesado como para conferir cierta densidad electrónica a las membranas y otras estructuras celulares a las que se une.
Después de la fijación con fijadores acuosos, las muestras se deshidratan en concentraciones crecientes de un solvente. Los solventes comunes que se usan son acetona o etanol, a menudo seguidos por óxido de propileno. Todos estos reactivos tienen la capacidad necesaria para extraer agua celular y luego servir como solventes para la resina de inclusión.
Existen métodos para la criofijación de muestras biológicas, que incluyen la congelación por inmersión, la congelación repentina y la congelación por chorro de propano. Se utiliza ampliamente la congelación por inmersión en propano o etano, principalmente para muestras subcelulares y monocapas de células de cultivo de tejidos. La congelación a alta presión suprime la formación de cristales de hielo muy dañinos ya que la muestra se enfría rápidamente (∼200 °C en 10 ms). Las ventajas de la congelación a alta presión son el cese rápido de la actividad celular, una conservación más fiel de la ultraestructura y una mejor retención de la antigenicidad para el inmunomarcaje posterior.
Las muestras de congelación a alta presión destinadas a la microscopía electrónica convencional se deshidratan a baja temperatura mediante un proceso denominado sustitución por congelación. Básicamente, el agua congelada dentro de la muestra se disuelve (en lugar de derretirse) en un solvente, generalmente acetona o metanol, a aproximadamente -80 a -90 °C.
La incrustación es el proceso de infiltrar la muestra con resinas que pueden polimerizarse en un plástico duro adecuado para cortes finos. Hay disponible una variedad de resinas de inclusión. Las resinas epoxi como Epon se encuentran entre las más fáciles de seccionar y permiten una excelente postinción.
Corte y tinción
Para ver la muestra en el microscopio electrónico se deben cortar secciones delgadas (∼60–80 nm) del bloque. La cara del bloque debe recortarse con un cuchillo de microtomo de vidrio hasta obtener un trapezoide limpio, generalmente <1 mm por lado. Cortar secciones muy pequeñas permite cargar docenas de secciones en serie en un soporte de muestra EM llamado rejilla. Una vez recortado, el bloque se monta en un ultramicrótomo, una máquina especializada que corta secciones del material haciendo avanzar lentamente la cara del bloque en pequeños incrementos controlados con precisión sobre un filo de diamante o de vidrio para producir secciones de un grosor determinado seleccionado por el operador.
Las secciones flotan desde el borde de la cuchilla del ultramicrótomo hacia un pequeño depósito lleno de agua integrado en la cuchilla, y las secciones deben transferirse con cuidado a rejillas metálicas. Cuando se hace bien, las secciones adyacentes se adhieren entre sí, creando una cinta de secciones en serie.
El paso final en la preparación de muestras antes de la obtención de imágenes es la tinción. Las tinciones de amplio espectro que contrastan con todos los constituyentes celulares, existen métodos para marcar selectivamente moléculas diana con anticuerpos.
Observación
Las secciones teñidas en rejillas ahora están listas para ser examinadas en el microscopio electrónico. Se inserta una rejilla en la columna del microscopio electrónico utilizando un soporte que coloca la rejilla en el haz de electrones. Los microscopios electrónicos modernos tienen interfaces de computadora extensas y fáciles de usar, lo que hace que sea relativamente simple aprender a operar los instrumentos de manera segura.
Las cámaras digitales no solo graban las imágenes, sino que también se utilizan para ubicar áreas de interés, enfocar y corregir el astigmatismo y han reemplazado casi universalmente a las películas tradicionales.
Una estrategia general para examinar una muestra es comenzar con un aumento bajo (en el rango de 100 a 1000x) para encontrar las secciones en la cuadrícula y elegir celdas para examinarlas con un aumento mayor. Los microscopios electrónicos pueden contar con herramientas de software que permiten al usuario mapear la cuadrícula y recordar ubicaciones específicas que luego se pueden volver a visitar automáticamente, una función que es particularmente útil para rastrear una celda determinada a través de secciones en serie.
El microscopio electrónico de transmisión es una técnica excelente por su capacidad para permitir ver el interior de la célula y apreciar la complejidad de una estructura u orgánulo elegido.
Guías de estudio. Homo medicus.
Fuente: Winey, Mark et al. “Conventional transmission electron microscopy.” Molecular biology of the cell vol. 25,3 (2014): 319-23.
Anatomía del hígado
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